Основные методы исследования в цитологии. Методы исследования в цитологии

Клеточный уровень организации жизни

§ 16. История изучения клетки. Методы цитологических исследований.

История изучения клетки.

Мир клеток оставался полностью неизвестным до середины XVII в., пока люди не научились шлифовать линзы и использовать их для расширения возможностей зрения.

Одним из первых создателей микроскопа был Роберт Гук физик, метеоролог, биолог, инженер, архитектор. В 1665 г. он издал альбом рисунков под названием «макрография», в котором были представлены его наблюдения под микроскопом.

Одним из одаренных современников Гука был голландец Антони ван Левенгук, который создал 200 микроскопов собственной особой конструкции. Левенгук добился увеличения объектов в 270 раз и сделал выдающиеся открытия.

Роберт Броун в 1833 г. открыл в клетке ядро. После 1825 г. Ян Пуркинье разработал эффективные методики приготовления и окраски препаратов для микроскопической техники.

Клеточную теорию предложил для растений в 1837 г. немецкий ботаник Матиас Шлейден, а распространил на животный мир его друг, физиолог Теодор Шванн. Несколько позже ее дополнил Рудольф Вирхов, который в 1885 г. сформулировал положение «Каждая клетка происходит из клетки».

В середине XIX в. клеточная теория стала общепризнанной и основой для науки о клетке - цитологии. К концу XIX в. было открыто много компонентов клеток. Ученые описали их и дали им названия.

Но в 1945 г. цитологи впервые заглянули в клетки с помощью электронного микроскопа и увидели много неизвестных ранее структур. Итак, решающая роль в развитии цитологии принадлежит новым открытием в других науках, в частности в физике.

Методы цитологических исследований.

Основным методом является метод световой микроскопии. Он предусматривает применение светового микроскопа, но рассмотреть под световым микроскопом можно только специально приготовленные цитологические препараты.

Для приготовления препаратов цитологи используют предметные стекла и специально подготовленные объекты, которые можно рассматривать.

Чаще всего эти структуры бесцветные, поэтому их необходимо красить специальными красителями, каждый раз разными, в зависимости от того, какие структуры желательно увидеть.

Существуют два метода: метод приготовления давлений препаратов - исследуемый объект просто раздавливается в один слой между предметным и накрывным стеклом, и метод приготовления тонких срезов, состоящие из одного слоя клеток.

Для изучения живых клеток применяют метод фазово-контрастной микроскопии. Он базируется на том, что отдельные участки прозрачной клетки отличаются друг от друга по плотности и светопреломления.

Изучая живые клетки, применяют также метод флуоресцентной микроскопии. Смысл его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться при поглощении ими световой энергии. Например, если в флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем теле будет видно красные зерна, ярко светятся, - это хлоропласты.

Существует метод, в котором используются меченые изотопы - метод авторадиографии - регистрации веществ, меченных изотопами. С помощью этого метода можно увидеть, к каким частям клетки попадают вещества, меченные радиоактивными изотопами.

Метод электронной микроскопии открыл цитолог те структуры клетки, которые имеют размеры, меньше длины световой волны. Благодаря этому методу появилась возможность рассмотреть вирусы и органеллы, на которых происходит синтез белка (рибосомы).

Цитологи могут также получать и изучать различные компоненты клеток с помощью фракционирования клеток. Клетку сначала разрушают, а затем выделяют клеточные структуры, используя специальное устройство - центрифугу.

Метод использования культуры клеток является методом длительного хранения и выращивания в специальных питательных средах клеток, тканей, небольших органов или их частей, выделенных из организма человека, животного или растения. Важным преимуществом этого метода является возможность наблюдения за жизнедеятельностью клеток с помощью микроскопа.

Значение цитологических методов в диагностике и лечении заболеваний человека.

1) Цитологические методы применяются в медицине для исследования физиологического состояния организма человека на основе изучения строения клеток. Они используются для выявления заболеваний крови, распознавания злокачественных и доброкачественных опухолей, многих заболеваний органов дыхания, пищеварения, мочевыделения, нервной системы и их лечение.

2) Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к самообновлению и развитию в специализированные клетки организма. Во взрослом организме стволовые клетки содержатся в основном в костном мозге и в очень небольшом количестве во всех органах и тканях. Их можно использовать для лечения многих заболеваний.

§ 17. Строение клеток прокариот и эукариот.

Единство строения клеток.

Содержание любой клетки отделен от внешней среды особой структурой - плазматической мембраной (плазмалемма). Эта обособленность позволяет создавать внутри клетки совсем особая среда, не похоже на то, что его окружает. Поэтому в клетке могут происходить те процессы, которые не происходят нигде, их называют процессами жизнедеятельности.

Внутренняя среда живой клетки, ограниченное плазматической мембраной, называется цитоплазмой. Она включает гиалоплазму (основную прозрачную вещество) и клеточные органеллы, а также различные непостоянные структуры - включения. К органелл, которые есть в любой клетке, относятся также рибосомы, на которых происходит синтез белка.

Строение клеток эукариот.

Эукариоты - это организмы, клетки которых имеют ядро. Ядро - это самая органеллы эукариотической клетки, в которой хранится и из которой переписывается наследственная информация, записанная в хромосомах. Хромосома - это молекула ДНК, интегрированная с белками. В ядре содержится ядрышко - место, где образуются другие важные органеллы, участвующих в синтезе белка - рибосомы. Но рибосомы только формируются в ядре, а работают они (т.е. синтезируют белок) в цитоплазме. Часть из них находится в цитоплазме свободно, а часть прикрепляется к мембран, образуют сетку, которая получила название эндоплазматической.

Рибосомы - немембранни органеллы.

Эндоплазматическая сеть - это сеть канальцев, ограниченных мембранами. Существует два типа: гладкая и гранулярная. На мембранах гранулярной эндоплазматической сети расположены рибосомы, поэтому в ней происходит синтез и транспортировки белков. А гладкая эндоплазматическая сеть - это место синтеза и транспортировки углеводов и липидов. На ней рибосом нет.

Для синтеза белков, углеводов и жиров необходима энергия, которую в эукариотической клетке производят «энергетические станции» клетки - митохондрии.

Митохондрии - двомембранни органеллы, в которых осуществляется процесс клеточного дыхания. На мембранах митохондрий окисляются органические соединения и накапливается химическая энергия в виде особых энергетических молекул (АТФ).

В клетке также есть место, где органические соединения могут накапливаться и откуда они могут транспортироваться, - это аппарат Гольджи, система плоских мембранных мешочков. Он участвует в транспортировке белков, липидов, углеводов. В аппарате Гольджи образуются также органеллы внутриклеточного пищеварения - лизосомы.

Лизосомы - одномембранни органеллы, характерные для клеток животных, содержат ферменты, которые могут расщеплять белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, липиды.

В клетке могут быть органеллы, не имеющие мембранной строения, например рибосомы и цитоскелет.

Цитоскелет - это опорно-двигательная система клетки, включает микрофиламенты, реснички, жгутики, клеточный центр, который производит микротрубочки и центриоли.

Существуют органеллы, характерные только для клеток растений, - пластиды. Бывают: хлоропласты, хромопласты и лейкопласты. В хлоропластах происходит процесс фотосинтеза.

В клетках растений также вакуоли - продукты жизнедеятельности клетки, являющиеся резервуарами воды и растворенных в ней соединений. В эукариотических организмов относятся растения, животные и грибы.

Строение клеток прокариот.

Прокариоты - одноклеточные организмы, в клетках которых нет ядра.

Прокариотические клетки малы по размерам, сохраняют генетический материал в форме кольцевой молекулы ДНК (нуклеоидом). В прокариотических организмов относятся бактерии и цианобактерии, которые раньше называли сине-зелеными водорослями.

Если в прокариот происходит процесс аэробного дыхания, то для этого используются специальные выпячивание плазматической мембраны - мезосомы. Если бактерии фотосинтезирующие, то процесс фотосинтеза происходит на фотосинтетических мембранах - тилакоидов.

Синтез белка в прокариот происходит на рибосомах. В прокариотических клетке мало органелл.

Гипотезы происхождения органелл эукариотических клеток.

Прокариотические клетки появились на Земле раньше, чем эукариотические.

1) симбиотические гипотеза объясняет механизм возникновения некоторых органоидов эукариотической клетки - митохондрий и фотосинтезирующих пластид.

2) Инвагинацыонная гипотеза - утверждает, что происхождение эукариотической клетки исходит из того, что предковой формы был аэробный прокариот. Органеллы в нем возникли в результате впячивания и отслоение частей оболочки с последующей функциональной специализацией в ядро, митохондрии, хлоропласты других органелл.

§ 18. Клеточные мембраны. Транспортировки веществ через мембраны. Поверхностный аппарат клетки, его функции.

Клеточные мембраны.

Биологические мембраны - это тонкие смежные структуры молекулярных размеров, расположенные на поверхности клеток и субклеточных частей, а также канальцев и пузырьков, пронизывающих протоплазму. Функция биологических мембран - регулирование транспортировки ионов, сахаров, аминокислот и других продуктов обмена веществ.

В основе любой мембраны лежит двойной слой фосфолипидов.

Однако билипидный слой - это еще не готова мембрана, а лишь ее основа. С билипидного слоем должны связаться белки, называемые мембранными белками. Именно мембранные белки определяют многие свойства мембран. Входят в состав мембран и углеводы, образуют комплексы с белками или липидами. Мембрана состоит из слоя билипидив, в котором плавают (или закреплены) белковые молекулы, образуя в нем своеобразную мозаику.

Строение мембраны соответствует ее функциям: транспортной, барьерной и рецепторной.

1) Барьерная функция. Мембрана является барьером, который предотвращает поступление в клетки различных химических веществ и других агентов.

2) Рецепторные функции. Поверхность мембраны имеет большой набор рецепторов, делающих возможными специфические реакции с различными агентами.

3) Транспортная функция. Через мембрану идет транспорт ионов и веществ.

Покрывая клетку и отделяя ее от окружающей среды, биологические мембраны обеспечивают целостность клеток и органелл. Она поддерживает неравномерное распределение ионов калия, натрия, хлора и других ионов между протоплазмой и окружающей средой.

Особенно важной мембраной в клетке является плазмалемма - поверхностная мембрана. Она выполняет барьерную, транспортную, рецепторную, сигнальную функции.

Транспортировки веществ через мембраны.

Существуют два активных процесса: экзоцитоз и эндоцитоз.

Из клетки вещества выводятся с помощью экзоцитоза - слияние внутриклеточных пузырьков с плазматической мембраной. В клетку вещества могут попадать посредством эндоцитоза. В процессе эндоцитоза плазматическая мембрана образует вогнутости и вырасти, которые потом, отслаивая, превращаются в пузырьки или вакуоли.

Различают два типа эндоцитоза:

- Пиноцитоз - поглощение жидкости и растворенных веществ с помощью небольших пузырьков;

- Фагоцитоз - поглощение крупных частиц, таких как микроорганизмы или остатки клеток.

В случае фагоцитоза образуются большие пузыри, которые называются вакуолями.

Молекулы проходят через мембраны благодаря процессам: простой диффузии, облегченной диффузии, активному транспортировке.

Простая диффузия - это пример пассивного транспортировки, проходит из зоны с большей концентрацией молекул в зону с меньшей концентрацией. Путем простой диффузии в клетку проникают неполярные (гидрофобные) вещества, растворимые в липидах, и мелкие незаряженные молекулы (например, вода). Однако большинство веществ переносится через мембрану с помощью погруженных в нее транспортных белков. Различают две формы обращения: облегченная диффузия и активное транспортировки.

Облегченная диффузия обусловлена ​​градиентом концентрации, и молекулы движутся согласно этому градиента. Однако молекула заряжена, то на ее транспортировку влияет как градиент концентрации, так и мембранный потенциал.

Активное транспортировки - это перенос растворенных веществ против градиента концентрации с использованием энергии АТФ. Энергия необходима потому, что вещество должно двигаться, вопреки своему естественному стремлению двигаться по диффузией, в противоположном направлении. Примером может служить натрий-калиевый насос. По законам диффузии ионы Nа постоянно движутся внутрь клетки, а ионы К + - из клетки. Нарушение необходимой концентрации этих ионов влечет за-гибель клетки.

Поверхностный аппарат клетки.

Разновидность клеток прокариот и эукариот состоит из частей: поверхностного аппарата, цитоплазмы, ядерного аппарата.

Поверхностный аппарат клетки выполняет три функции, универсальные для всех видов клеток: барьерную, транспортную, рецепторную. Он может осуществлять и ряд специфических функций (например, механическая тургорного функция клеточной стенки в растительных клетках). Поверхностный аппарат клеток состоит из систем: плазматической мембраны, надмембранный комплекса и субмембранного (т.е. пидмембранного) опорно-сократительного аппарата.

Плазматическая мембрана, или плазмалемма, - это основная, универсальная для всех клеток система поверхностного аппарата. Под ней расположена субмембранна система, которая участвует в трансмембранному транспортировке и рецепции и является частью цитоплазмы.

Надмембранная структура поверхностного аппарата осуществляют взаимодействие клеток с внешней средой или с другими клетками. У клеток животных надмембранный комплекс, или гликокаликс, играет важную роль в рецепторной функции клеток. Гликокаликс состоит из углеводов, он сравнительно тонкий и эластичный.

К производным надмембранным структурам принадлежит клеточная стенка. Ее должны клетки растений, грибов и бактерий. Клеточная стенка растений содержит целлюлозу, грибов - хитин, бактерий - муреин. Она достаточно жесткая, не сжимается. Через клеточную стенку проходит вода, соли, молекулы многих органических веществ. Явление плазмолиза и деплазмолиза в клетках растений.

Плазмолиз - это отделение цитоплазмы от оболочки при погружении клетки в гипертонический, т.е. концентрированные извне, раствор. Если животные клетки погрузить в гипертонический раствор, то они сжимаются. Иногда плазмолизованые клетки остаются живыми. Если погрузить такие клетки в воду, в которой концентрация солей ниже, чем в клетке, происходит деплазмолиз.

Деплазмолиз - это возвращение цитоплазмы клеток растений из состояния плазмолиза в исходное состояние.

Ч. 1

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ

Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое значение имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов смежных наук - биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования не только позволяют изучать ткани как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изучения их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты - ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись в связи с созданием новых приборов и технологий - различных типов микроскопов, компьютерной техники, рентге-ноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получения гибридов; использования биотехнологических методов - получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.

Таким образом, биологические объекты можно изучать на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на внедрение в естественные науки разнообразных биохимических, биофизических, физических и технологических методов, необходимых для решения многих вопросов, связанных с жизнедеятельностью клеток и тканей, гистология в своей основе остается морфологической наукой с присущим ей набором методов. Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, его подготовка для изучения под микроскопом, качественный и количественный анализ изображений гистологических элементов.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клетки и ткани, их изображения, полученные при использовании световых и элек-

тронных микроскопов или на экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.

2.1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Основным методом изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - главный метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть с помощью микроскопа, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d = λ/2. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние, и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с волнами различной длины. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет (рис. 2.1). Минимальная длина волны видимой части спектра примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние приблизительно составляет 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.

Таким образом, с помощью светового микроскопа можно увидеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротко-

Рис. 2.1. Микроскопы для биологических исследований:

а - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - ту-бусодержатель; 3 - наклонный тубус; 4 - окуляр; 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диафрагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зеркало; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт; б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизированной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образцов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок анализа изображений; 5 - датчик видеосигнала; в - конфокальный микроскоп: 1 - световой микроскоп; 2 - регистратор изображения (фотоэлектронный умножитель);

3 - сканирующее устройство для перемещения светового луча по оси X, Y, Z;

4 - блок питания и стойка управления лазерами; 5 - компьютер для обработки изображений

волновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксе-ноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридиновый оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов акридиновым оранжевым ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Существует много красителей, с помощью которых можно выявить белки, липиды, внутриклеточные ионы кальция, магния, натрия и др. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцентной микроскопии.

Для повышения контрастности флюорохромированных объектов применяется конфокальный вариант оптического микроскопа (см. рис. 2.1, в). В качестве освещения используется пучок монохроматического света малого диаметра, который создает лазерный источник. В каждый момент времени в фокусе микроскопа находится небольшой участок (объем) клетки. Пучок света перемещается по объекту (сканирует объект по осям X, Y, Z). При каждом перемещении пучка света по одной из линий сканирования получается информация об исследуемой структуре, находящейся в данной точке (объеме) по линии сканирования (оптическом срезе клетки), например о локализации белков в составе микротрубочек в клетке. Вся полученная информация от каждой точки сканирования клетки передается на компьютер, объединяется с помощью специальной программы и выдается на экран монитора в виде контрастного изображения. С помощью данного метода микроскопии получается информация о форме клеток, цитоскеле-те, структуре ядра, хромосом и др. С помощью программы компьютер на основе полученной информации по каждой линии сканирования создает объемное изображение клетки, что позволяет рассматривать клетку под разными углами зрения.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод основан на том, что свет, проходя структуры с различным коэффициентом преломления, изменяет свою скорость. Используемая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т. е. яркости получаемого изображения. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию (огибание волнами) структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. В клинике этот метод применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности Treponema pallidum, вызывающей сифилис, и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани. Дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского) используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяется по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка накладываются друг на друга. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется интерференция, возникающая при комбинации двух наборов волн и создающая изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темно-польной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микровидеосъемки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: первый (поляризатор) - между пучком света и объектом, а второй (анализатор) - между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось,

которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры, обладают свойством вращать ось световых лучей, исходящих из поляризатора. При изменении оси вращения данные структуры проявляются как светящиеся на темном фоне. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии было создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 2.1). В электронном микроскопе используется поток электронов с волнами более короткими, чем в световом микроскопе. При напряжении 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т. е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В гистологии используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ), сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ) и их модификации. С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Современными вариантами приборов для изучения поверхности объекта является атомно-силовой микроскоп и сканирующий туннельный микроскоп.

Электронная микроскопия с использованием метода замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 °С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультрамикро-томии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных тканей и органов. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, брюшины, плевры, мягкой оболочки мозга), тонкий срез. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки, например с применением фазово-контрастного микроскопа. Наиболее часто для световой микроскопии используются срезы ткани или органа с последующей их окраской.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой микроскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие

прозрачные среды (5). Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходит необратимая коагуляция белков, вследствие которой жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными.

Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, производится путем обезвоживания спиртами возрастающей концентрации и пропитывания парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится с помощью специальных приборов - микротомов и замораживающих микротомов, или криостатов (для световой микроскопии) и ультрамикротомов (для электронной микроскопии). Толщина среза для светооптического исследования колеблется от 5 до 20 мкм, а для электронной микроскопии - от 40 до 100 нм. Для сравнения 1 мм равен 1000 мкм и 1 000 000 нм.

Окрашивание срезов (для световой микроскопии) или напыление их солями металлов (для электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель гематоксилин, который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными (ацидофильными, эозинофильными), а окрашивающиеся основными - базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Существуют структуры клетки, которые окрашиваются в цвет, отличный от цвета используемого красителя. Это явление называется метахромазия. Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полученные с помощью ультрамикротома, помещают на специальные сетки, контрастируют солями свинца, кобальта, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности - проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов.

Прижизненные исследования клеток в организме (in vivo). Одним из прижизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме. С помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюминаторов, например, можно изучать в динамике циркуляцию крови в микрососудах. После проведения анестезии у животного объект исследования (например, брыжейка кишки) выводят наружу и рассматривают с помощью микроскопа, при этом ткани должны постоянно увлажняться изотоническим раствором натрия хлорида. Однако длительность такого наблюдения ограничена. Лучшие результаты дает метод вживления прозрачных камер в организм животного.

Наиболее удобным органом для вживления таких камер и последующего наблюдения является ухо какого-либо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих условиях изучают динамику изменения клеток и тканей в течение продолжительного времени. Так могут изучаться процессы выселения лейкоцитов из кровеносных сосудов, различные стадии образования соединительной ткани, капилляров, нервов и другие процессы. В качестве естественной прозрачной камеры можно использовать глаз экспериментальных животных. Клетки, ткани или образцы органов помещают в жидкость передней камеры глаза в угол, образованный роговицей и радужкой, и наблюдение ведут через прозрачную роговицу. Таким образом была проведена трансплантация оплодотворенной яйцеклетки и прослежены ранние стадии развития зародыша. Обезьянам были пересажены небольшие кусочки матки и изучены изменения ее слизистой оболочки в различные фазы менструального цикла.

Широкое применение нашел метод трансплантации клеток крови и костного мозга от здоровых животных-доноров животным-реципиентам, подвергнутым смертельному облучению. Животные-реципиенты после трансплантации оставались живыми вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток. Исследование числа колоний и их клеточного состава позволяет выявлять количество родоначальных кроветворных клеток и различные стадии их дифференцировки. С помощью метода колониеобразования установлены источники развития всех клеток крови.

Витальное и суправитальное окрашивание. При витальном (прижизненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Например, с помощью трипанового синего или литиевого кармина выявляют фагоциты, а с помощью ализарина - новообразованный матрикс кости.

Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые формы эритроцитов - ретикулоциты крови (краситель бриллиантовый крезиловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro). Этот метод является одним из самых распространенных. Выделенные из организма человека или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду - плазму крови, эмбриональный экстракт, а также искусственные среды.

Различают суспензионные культуры (клетки взвешены в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечиваются стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря изменениям в их геноме могут сохраняться и размножаться в культуре, образуя непрерывные клеточные линии. В разработку методов культивирования клеток и тканей большой вклад внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопин, А. Д. Тимофеевский, Ф. М. Лазаренко. В настоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, которые существуют многие годы.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток с вирусами и микробами. Особую значимость метод культивирования тканей имеет для проведения экспериментальных наблюдений. Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей использоваться для определения пола, наследственных заболеваний, злокачественного перерождения, выявления действия ряда токсичных веществ.

Клеточные культуры широко применяются для гибридизации клеток.

Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделение отдельных типов клеток и их культивирования. Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных контактов и внеклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов (трипсин, коллагеназа) и соединений, связывающих Са 2+ (с помощью ЭДТА - этилендиаминтетраацетата). Далее полученную суспензию разделяют на фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток неодинакова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности стекла используют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. Прилипшие клетки затем отделяют, разрушая

матрикс ферментами, при этом получают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является мечение антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно-активируемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 секунду около 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.

Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, размножение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками и др.

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным методом диссоциации ткани. Большинство клеток не способны расти в суспензии, им необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пластиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрикса, например коллагена. Первичными культурами называют культуры, приготовленные непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, вторичными - культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно последовательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраняют характерные для них гистогенетические признаки (например, клетки эпителия образуют пласты). Исходным материалом для клеточных культур обычно служат эмбриональные ткани и ткани новорожденных.

В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витаминов, сыворотки крови, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыворотку и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирования различных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста нервных клеток необходим фактор роста нервов.

У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50-100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, которые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробла-сты, эпителиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, но клетки растут без прикрепления к твердой поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плотную популяцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухолеродными вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопластически трансформированные клеточные линии. Клеточные линии нетрансформированных и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах (-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонированием, когда из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию однородных клеток. Клон - это популяция клеток, происходящих из одной клетки-предшественника.

Клеточные гибриды. При слиянии двух клеток различных типов образуется гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерокариона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактивирован-ными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клетки способны к слиянию. Например, неактивное ядро эритроцита курицы становится активным (синтез РНК, репликация ДНК) при слиянии клеток и переносе в цитоплазму другой клетки, растущей в культуре ткани. Гетерокарион способен к митозу, в результате чего образуется гибридная

клетка. Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются, и их хромосомы объединяются в одном большом ядре.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в гибридной клеточной линии «мышь-человек» установлена роль хромосомы 11 человека в синтезе инсулина.

Гибридомы. Клеточные линии гибридом используют для получения моно-клональных антител. Антитела вырабатываются плазмоцитами, которые образуются из В-лимфоцитов при иммунизации. Определенный вид антител получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоцитов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертными» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридомы (гибрид-клетка с геномом от двух разных клеток; ома - окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гибридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы антител данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания антигенов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных молекул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает разделение цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК. Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессии.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Для изучения химического состава биологических структур - локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и орга-

нов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для контроля специфичности реакции часто применяют соответствующие ферменты. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

Сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях. Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные частицы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать специальными приборами. Радиоактивные изотопы используют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3 Н-тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3 Н-уридина - РНК.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов (например, фосфора 32 Р, углерода 14 С, серы 35 S, водорода 3 Н) или меченных ими соединений. Радиоактивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках препарата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включения меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и др.

Методы иммунофлюоресцентного и иммуноцитохимического анализа. Применение антител. Антитела - защитные белки, вырабатываемые плаз-моцитами (производными В-лимфоцитов) в ответ на действие чужеродных веществ (антигенов). Количество различных форм антител достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул, вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Метод основан на реакциях антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав, который глав-

ным образом определяется белками. Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией клеток, - клонами (одна линия - один клон), полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью и в неограниченных количествах. Антитела можно использовать для изучения антигенов как на световом, так и на ультраструктурном уровнях с помощью электронного микроскопа. В клинической диагностике широкое применение получили методы иммуногистохимии на парафиновых срезах. Предложено большое количество молекулярных маркеров и методов обнаружения белков промежуточных филаментов, пролиферативных, дифференцировочных и апоптозных белков в клетках. Для стандартизации обработки препаратов используется иммуностейнер - устройство, с помощью которого все операции проводятся без вмешательства со стороны исследователя.

Методы иммунофлюоресцентного и иммуногистохимического анализов широко и эффективно используются в научных исследованиях и в лабораторной диагностике. Продукты реакции можно окрашивать флюоресцирующими красителями и выявлять в люминесцентном микроскопе или использовать специальные наборы реактивов, которые окрашивают исследуемые белки, и анализировать препараты с помощью светового микроскопа. Эти методы применяются для изучения процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур. Методы позволяют с высокой точностью охарактеризовать функциональное состояние клеток, выявить гистогенетическую принадлежность и трансформацию клетки при онкологических заболеваниях.

Фракционирование клеточного содержимого. Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различными методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофорезом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии.

Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клетки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматическая сеть) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пузырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей суспензии.

Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высокоскоростную центрифугу (80 000-150 000 об./мин). Вначале оседают (седи-ментируются) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадоч-ных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала митохондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пузырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифугировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фракционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широ-

ко используют для изучения внутриклеточных процессов, например для изучения биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др.

Хроматография широко используется для фракционирования белков.

Электрофорез позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их водных растворов (или в твердом пористом матрик-се) в электрическом поле.

Методы хроматографии и электрофореза применяют для анализа пептидов, получаемых при расщеплении белковой молекулы, и получения так называемых пептидных карт белков. Подробно эти методы описаны в учебниках биохимии.

Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределения веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерного магнитного резонанса и микроэлектродную технику.

Ядерный магнитный резонанс позволяет изучать малые молекулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы, которые характеризуются способностью поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. В биологии сигнал ЯМР от протонов (ядер водорода) широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и др. Для изучения макромолекул внутри живой клетки часто применяют изотопы 3 Н, 14 С, 32 Р для получения сигнала ЯМР и слежения за его изменением в процессе жизнедеятельности клетки. Так, изотоп фосфора используется для изучения мышечного сокращения - изменений содержания в тканях АТФ и неорганического фосфата. Изотоп углерода позволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глюкоза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2 ммоль исследуемого вещества. Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток.

Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводящим раствором (обычно раствор КС1 в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрометра. Кончик такой трубочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять концентрацию ионов Н+, Na+, К+, С1 - , Са 2 +, Mg 2 +, разность потенциалов на плазмолемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концентрации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые заполняют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона. Микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолемме. При этом используют микроэлектрод, который плотно прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет исследовать функцию одиночной белковой молекулы. Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. Например, для изучения внутриклеточной концентрации Са 2+ используют люминесцентный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са 2+ и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5-10 мкмоль. Синтезированы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающиеся с Са 2+ . Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и современных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внутриклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы определения содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественных гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения монохроматического света, которая зависит от концентрации вещества, производится определение его содержания в клетке. Так, например, определяется содержание ДНК в ядре, РНК и суммарного белка в цитоплазме и др.

Цитоспектрофлюориметрия - метод количественного изучения внутриклеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции при облучении препарата заранее выбранной длиной световой волны (цитофлюориметрия). При этом используются флюорохромы, количественно связывающиеся с веществами клетки (ДНК, РНК, белками и др.).

Современные микроскопы - цитофлюориметры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10 -14 -10 -16 г) и оценить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах.

Интерферометрия. Этот метод позволяет оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетках. С помощью этого метода, например, можно установить суммарное содержание белков в живых и фиксированных клетках.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ СТРУКТУР

Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвергаться специальному анализу - выявлению морфометрических, денситометрических параметров и их статистической обработке. Морфометрические методы позволяют определять с помощью специальных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, площади их сечений, диаметры и др. В частности в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазматические отношения и др. Существуют ручная морфометрия и автоматизированная морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически.

Все большее распространение получают автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количественной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основан-

ными на обработке с помощью электронно-вычислительных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усиливающих оптические возможности зрительного анализатора человека, но и многократно расширяющих его аналитические возможности. Это позволяет получать новую информацию о не выявляемых ранее процессах, моделировать и прогнозировать их развитие в клетках и тканях.

Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алгоритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования.

Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности организации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки.
ч. 1

Основы цитологии

Клетка. Клеточная теория.

Клетка - мельчайшая структура, способная к самовоспроизведению. Термин «клетка» был введен Р. Гуком в 1665 г. (он изучал с помощью микроскопа срез стебля бузины - сердцевину и пробку; хотя сам Гук видел не клетки, а их оболочки). Совершенствова­ние микроскопической техники позволило выявить разнообразие форм клеток, сложность строения ядра, процесс деления клеток и др. Микроскоп был усовершенствован Антони ван Левенгуком (его микроскопы давали увеличение в 270-300 раз).

Другие ме­тоды исследования клетки:

1. дифференцированное центрифугирование - основано на том, что различные клеточные структуры имеют разную плотность. При очень быстром вращении в приборе (ультрацентрифуге) органеллы тонко измельченных клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь слоями в соответствии со своей плотностью. Эти слои разделяют и изучают.
2. электронная микроскопия - используется с 30-х годов 20-го века (когда был изобретен электронный микроскоп - он дает увеличение до 10 6 раз); с помощью этого метода изучают строение мельчайших структур клетки, в т.ч. отдельных органелл и мембран.
3. авторадиография - метод, позволяющий анализировать локализацию в клетках веществ, меченных радиоактивными изотопами. Так выявляют места синтеза веществ, состав белков, пути внутриклеточного транспорта.
4. фазово-контрастная микроскопия - используется для исследования прозрачных бесцветных объектов (живых клеток). При прохождении через такую среду световые волны смещаются на величину, определяемую толщиной материала и скоростью проходящего через него света. Фазово-контрастный микроско­п преобразует эти сдвиги в черно-белое изображение.
5. рентгеноструктурный анализ - изучение клетки с помощью рентгеновских лучей.

В 1838-1839 гг. ботаником Матиасом Шлейденом и физиологом Теодором Шванном была создана клеточная теория . Ее суть заключалась в том, что основным структурным элементом всех живых организмов (растений и животных) является клетка.

Основные положения клеточной теории :

1. клетка - элементарная живая система; основа строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития организмов.
2. клетки различных тканей организма и клетки всех организмов сходны по строению и химическому составу.
3. новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток.
4. рост и развитие любого многоклеточного организма есть следствие роста и размножения одной или нескольких исходных клеток.

Молекулярный состав клетки.

Химические элементы, входящие в состав клеток и выполняющие какие-либо функции, называются биогенными . По содержанию элементы, входящие в состав клетки, делятся на три группы:

1. макроэлементы - составляют основную массу клетки - 99%. Из них 98% приходится на 4 элемента: С, О, Н и N. Также к этой группе относятся К, Мg, Са, Р, С1, S, Na, Fe.
2. микроэлементы - к ним относятся в основном ионы, входящие в состав ферментов, гормонов и др. веществ. Их концентрация от 0,001 до 0,000001 % (В, Си, Zn. Br, I, Mo и т.д.).
3. ультрамикроэлементы - их концентрация не превышает 10 -6 %, а физиологическая роль не выявлена (Аи, Аg, U, Ra).

Химические компоненты живого делятся на неорганические (вода, минеральные соли) и органические (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, витамины).

Вода. За небольшим исключением (кость и эмаль зубов), вода является преобладающим компонентом клеток - в среднем 75-85%. В клетке вода находится в свободном и связанном состоянии. Молекула воды представляет собой диполь - на одном конце отрицательный заряд, на другом - положительный, но в целом молекула электронейтральна. Вода имеет высокую теплоемкость и относительно высокую для жидкостей теплопроводность.

Биологическое значение воды: универсальный растворитель (для полярных веществ, неполярные вещества в воде не растворяются); среда для реакций, участник реакций (расщепление белков), участвует в поддержании теплового равновесия клетки; источник кислорода и водорода при фотосинтезе; основное средство передвижения веществ в организме.

Ионы и соли. Соли входят в состав костей, панцирей, раковин и т.п., т.е. выполняют опорную и защитную функции, а также участвуют в минеральном обмене. Ионы входят в состав различных веществ (железо - гемоглобин, хлор - соляная кислота в желудке, магний - хлорофилл) и участвуют в регуляторных и иных процессах, а также в поддержании гомеостаза.

Белки. По содержанию в клетке занимают первое место из органических веществ. Белки - это нерегулярные полимеры, состоящие из аминокислот. В состав белков входят 20 разных аминокислот. Аминокислота:

NH 2 -CH-COOH | R

Соединение аминокислот происходит следующим образом: аминогруппа одной кислоты соединяется с карбоксильной группой другой, при этом выделяется молекула воды. Образовавшаяся связь называется пептидной (разновидность ковалентной), а само соединение - пептидом . Соединение из большого числа аминокислот называется полипептидом . Если белок состоит только из аминокислот, то его называют простым (протеином ), если в него входят другие вещества, то сложным (протеидом ).

Пространственная организация белков включает 4 структуры:

1. Первичная (линейная) - полипептидная цепь, т.е. нить аминокислот, соединенных ковалентными связями.
2. Вторичная - белковая нить закручивается в спираль. В ней возникают водородные связи.
3. Третичная - спираль далее свертывается, образуя глобулу (клубок) или фибриллу (вытянутая структура). В ней возникают гидрофобные и электростатические взаимодействия, а также ковалентные дисульфидные -S-S- связи.
4. Четвертичная - соединение нескольких макромолекул белка вместе.

Разрушение структуры белка называется денатурацией . Она бывает необратимой (если повреждается первичная структура) или обратимой (если повреждаются другие структуры).

Функции белков:

1. ферменты - это биологически активные вещества, они катализируют химические реакции. Известно более 2000 ферментов. Свойства ферментов: специфичность действия (каждый действуют только на определенное вещество - субстрат), активность только в определенной среде (каждый фермент имеет свой оптимальный диапазон рН) и при определенной температуре (при повышении температуры увеличивается вероятность денатурации, поэтому активность фермента снижается), большая эффективность действия при малом их содержании. Любой фермент имеет активный центр - это особый участок в структуре фермента, к которому присоединяется молекула субстрата. В настоящее время на основании строения ферменты делят на две основные группы: полностью белковые ферменты и ферменты, состоящие из двух частей: апофермента (белковая часть) и кофермента (небелковая часть; это ион или молекула, связывающаяся с белковой частью, образуя при этом каталитически активный комплекс). Коферментами являются ионы металлов, витамины. Без кофермента апофермент не функционирует.
2. регуляторные - гормоны.
3. транспортные - гемоглобин.
4. защитные - иммуноглобулины (антитела).
5. движение - актин, миозин.
6. строительная (структурная).
7. энергетическая - крайне редко, только после того, когда закончились углеводы и липиды.

Углеводы - органические вещества, в состав которых входит С, О и Н.Общая формула: С n (Н 2 О) n , где n не менее 3-х. Они делятся на 3 класса: моносахариды, дисахариды (олигосахариды) и полисахариды.

Моносахариды (простые углеводы) - состоят из одной молекулы, это твердые кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде, имеющие сладкий вкус. Рибоза и дезоксирибоза (С 5) - входят в состав ДНК и РНК. Глюкоза (С 6 Н 12 О 6) - входит в состав полисахаридов; основной первичный источник энергии в клетке. Фруктоза и галактоза - изомеры глюкозы.

Олигосахариды - состоят из 2, 3 или 4-х остатков моносахаридов. Наиболее важны дисахариды - они состоят из 2 остатков; хорошо растворимы в воде, сладкие на вкус. Сахароза (С 12 Н 22 О 11) - состоит из остатков глюкозы и фруктозы; широко распространена в растениях. Лактоза (молочный сахар) - состоит из глюкозы и галактозы. Важнейший источник энергии для детенышей млекопитающих. Мальтоза - состоит из 2-х молекул глюкозы. Это основной структурный элемент крахмала и гликогена.

Полисахариды - высокомолекулярные вещества, состоящие из большого числа остатков моносахаридов. Плохо растворимы в воде, не имеют сладкого вкуса. Крахмал - представлен двумя формами: амилоза (состоит из остатков глюкозы, соединенных в неразветвленную цепь) и амилопектин (состоит из остатков глюкозы, линейные и разветвленные цепи). Гликоген - полисахарид животных и грибов. По структуре напоминает крахмал, но сильнее разветвлен. Клетчатка (целлюлоза) ­ - главный структурный полисахарид растений, входит в состав клеточных стенок. Это линейный полимер.

Функции углеводов:

1. энергетическая - 1 г при полном распаде дает 17,6 кДж.
2. Структурная.
3. Опорная (у растений).
4. Запас питательных веществ (крахмал и гликоген).
5. Защитная - вязкие секреты (слизи) богаты углеводами и предохраняют стенки полых органов.

Липиды - объединяют жиры и жироподобные вещества - липоиды . Жиры - это сложные эфиры жирных кислот и глицерина. Жирные кислоты: пальмитиновая, стеариновая (насыщенные), олеиновая (ненасыщенная). Растительные жиры богаты ненасыщенными кислотами, поэтому они легкоплавкие, при комнатной температуре - жидкие. Животные жиры содержат в основном насыщенные кислоты, поэтому они более тугоплавкие, при комнатной температуре - твердые. Все жиры нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в неполярных растворителях; плохо проводят тепло. К жирам относятся фосфолипиды (это основной компонент мембран клеток) - в их состав входит остаток фосфорной кислоты. К липоидам относятся стероиды, воска и др.

Функции липидов:

1. структурная
2. энергетическая - 1 г при полном распаде дает 38,9 кДж.
3. Запас питательных веществ (жировая ткань)
4. Терморегуляция (подкожный жир)
5. Поставщики эндогенной воды - при окислении 100 г жира выделяется 107 мл воды (принцип верблюда)
6. Защита внутренних органов от повреждения
7. Гормоны (эстрогены, андрогены, стероидные гормоны)
8. Простагландины - регуляторные вещества, поддерживают тонус сосудов и гладких мышц, участвуют в иммунных реакциях.

АТФ (аденозинтрифосфорная кислота). Энергия, освобождающаяся при распаде органических веществ, используется для работы в клетках не сразу, а сначала запасается в форме высокоэнергетического соединения - АТФ. АТФ состоит из трех остатков фосфорной кислоты, рибозы (моносахарид) и аденина (остаток азотистого основания). При отщеплении одного остатка фосфорной кислоты образуется АДФ, а если отщепляется два остатка - то АМФ. Реакция отщепления каждого остатка сопровождается освобождением 419 кДж/моль. Такая фосфорно-кислородная связь в АТФ называется макроэргической . АТФ имеет две макроэргические связи. АТФ образуется в митохондриях из АМФ, которая присоединяет сначала один, затем второй остаток фосфорной кислоты с поглощением 419 кДж/моль энергии (или из АДФ с присоединением одного остатка фосфорной кислоты).

Примеры процессов, требующих больших затрат энергии: биосинтез белка.

Нуклеиновые кислоты - это высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной информации. Впервые описаны в 19-ом веке (1869 г.) швейцарцем Фридрихом Мишером. Существует две разновидности нуклеиновых кислот.

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота)

Содержание в клетке строго постоянно. В основном находится в ядре (где образует хромосомы, состоящие из ДНК и двух видов белков). ДНК - это нерегулярный биополимер, мономером которого является нуклеотид, состоящий из азотистого основания, остатка фосфорной кислоты и моносахарида дезоксирибозы. В ДНК существует 4 разновидности нуклеотидов: А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). А и Г относятся к пуриновым основаниям, Ц и Т - к пиримидиновым. При этом в ДНК число пуриновых оснований равно числу пиримидиновых, а также А=Т и Ц=Г (правило Чаргаффа).

В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик открыли, что молекула ДНК представляет собой двойную спираль. Каждая спираль состоит из полинуклеотидной цепи; цепи закручены одна вокруг другой и вместе вокруг общей оси, каждый виток спирали содержит 10 пара нуклеотидов. Цепи удерживаются вместе водородными связями, возникающими между основаниями (между А и Т - две, между Ц и Г - три связи). Полинуклеотидные цепи комплементарны друг другу: напротив аденина в одной цепи всегда находится тимин другой и наоборот (А-Т и Т-А); напротив цитозина - гуанин (Ц-Г и Г-Ц). Этот принцип строения ДНК называется принципом дополнения или комплементарности.

Каждая цепь ДНК имеет определенную ориентацию. Две цепи в молекуле ДНК расположены в противоположном направлении, т.е. антипараллельно.

Основная функция ДНК - хранение и передача наследственной информации.

РНК (рибонуклеиновая кислота)

1. и-РНК (информационная РНК) - содержится в ядре и цитоплазме. Ее функция - перенос информации о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка.
2. т-РНК (транспортная РНК) - в основном в цитоплазме клетки. Функция: перенос молекул аминокислот к месту синтеза белка. Это самая маленькая РНК.
3. р-РНК (рибосомная РНК) - участвует в образовании рибосом. Это самая крупная РНК.

Строение клетки.

Основными компонентами клетки являются: наружная клеточная мембрана, цитоплазма и ядро.

Мембрана. В состав биологической мембраны (плазмалеммы ) входят липиды, составляющие основу мембраны и высокомолекулярные белки. Молекулы липидов полярные и состоят из несущих заряд полярных гидрофильных головок и неполярных гидрофобных хвостов (жирные кислоты). В основном в мембране содержатся фосфолипиды (они имеют в своем составе остаток фосфорной кислоты). Белки мембраны могут быть поверхностными , интегральными (пронизывают мембрану насквозь) и полуинтегральными (погружены в мембрану).

Совре­менная модель биологической мембраны получила название «универсальная жидкостно-мозаичная модель» , согласно которой глобулярные белки погружены в двойной липидный слой, при этом одни белки пронизывают его насквозь, другие - частично. Считается, что интегральные белки амфифильны, их неполярные участки погружены в двойной липидный слой, а полярные выступают наружу, образуя гидрофильную поверхность.

Субмембранная система клетки (подмембранный комплекс). Представляет собой специализированную периферическую часть цитоплазмы и занимает пограничное положение между рабочим метаболическим аппаратом клетки и плазматической мембраной. В субмембранной системе поверхностного аппарата можно выделить две части: периферическую гиалоплазму , где сосредоточены ферментативные системы, связанные с процессами трансмембранного транспорта и рецепции, и структурно оформленную опорно-сократимую систему . Опорно-сократимая система состоит из микрофибрилл, микротрубочек и ске­летных фибриллярных структур.

Надмембранные структуры клеток эукариот можно разделить на две большие категории.

1. Собственно надмембранный комплекс , или гликокаликс толщиной 10-20 нм. В его состав входят периферические белки мембраны, углеводные части гликолипидов и гликопротеинов. Гликокаликс играет важную роль в рецепторной функции, обеспечивает «индивидуализацию» клетки - в его составе сосредоточены рецепторы тканевой совместимости.
2. Производные надмембранных структур . К ним относятся специфические химические соединения, не производящиеся самой клеткой. Наиболее изучены они на микроворсинках клеток кишечного эпителия млекопитающих. Здесь ими являются гидролитические ферменты, адсорбирующиеся из полости кишки. Их переход из взвешенного в фиксированное состояние создает базу для качественно иного типа пищеварения, так называемого пристеночного пищеварения. Последнее по своей сути занимает промежуточное положение между полостным и внутриклеточным.

Функции биологической мембраны:

1. барьерная;
2. рецепторная;
3. взаимодействие клеток;
4. поддержание формы клетки;
5. ферментативная активность;
6. транспорт веществ в клетку и из нее.

Мембранный транспорт:

1. Для микромолекул. Выделяют активный и пассивный транспорт.

   К пассивному относятся осмос, диффузия, фильтрация. Диффузия - транспорт вещества в сторону меньшей концентрации. Осмос - движение воды в сторону раствора с большей концентрацией. С помощью пассивного транспорта двигаются вода, жирорастворимые вещества.

   К активному транспорту относятся: перенос веществ с участием ферментов-переносчиков и ионные насосы. Фермент-переносчик связывает переносимое вещество и «протаскивает» его внутрь клетки. Механизм ионного насоса рассматривается на примере работы калиево-натриевого насоса : во время его работы происходит перенос трех Nа+ из клетки на каждые два К+ в клетку. Насос действует по принципу открывающихся и закрывающихся каналов и по своей химической природе является белком-ферментом (расщепляет АТФ). Белок связывается с ионами натрия, изменяет свою форму, и внутри него образуется канал для прохождения ионов натрия. После прохождения этих ионов белок снова меняет форму и открывается канал, через который идут ионы калия. Все процессы энергозависимы.

   Принципиальное отличие активного транспорта от пассивного заключается в том, что он идет с затратами энергии, а пассивный - без них.

2. Для макромолекул. Происходит с помощью активного захвата мембраной клетки веществ: фагоцитоза и пиноцитоза. Фагоцитоз - захват и поглощение клеткой крупных частиц (например, уничтожение патогенных микроорганизмов макрофагами организма человека). Впервые описан И.И. Мечниковым. Пиноцитоз - процесс захвата и поглощения клеткой капель жидкости с растворенными в ней веществами. Оба процесса происходят по сходному принципу: на поверхности клетки вещество окружается мембраной в виде вакуоли, которая перемещается внутрь. Оба процесса связаны с затратой энергии.

Цитоплазма. В цитоплазме различают основное вещество (гиалоплазму, матрикс), органеллы (органоиды) и включения.

Основное вещество заполняет пространство между плазмалеммой, ядерной оболочкой и другими внутриклеточными структурами. Она образует внутреннюю среду клетки, которая объединяет все внутриклеточные структуры и обеспечивает их взаимодействие друг с другом. Цитоплазма ведет себя как коллоид, способный переходить из состояния ге­ля в золь и обратно. Золь - это состояние вещества, характеризующееся низкой вязкостью и лишенное сшивок между микрофиламентами. Гель - это состояние вещества, характеризующееся высокой вязкостью и наличием связей между микрофиламентами. Наружный слой цитоплазмы, или эктоплазма, отличается более высокой плотностью и лишена гранул. Примеры процессов, осуществляющихся в матриксе: гликолиз, распад веществ до мономеров.

Органеллы - структуры цитоплазмы, выполняющие в клетке специфические функции.

Органеллы бывают:

1. мембранные (одно- и двумембранные (митохондрии и пластиды)) и немембранные.
2. органеллы общего значения и специальные. К первым относятся: ЭПС, аппарат Гольджи, митохондрии, рибосомы и полисомы, лизосомы, клеточный центр, микротельца, микротрубочки, микрофиламенты. Органеллы специаль­ного назначения (присутствуют в клетках, выполняющих специализированные функции): реснички и жгутики (движение клетки), микроворсинки, синаптические пузырьки, миофибриллы.

органоид	строение	функции
мембранные
ЭПС	система соединенных между собой канальцев и полостей различной формы и величины. Образует непрерывную структуру с ядерной мембраной. Бывает двух видов: гладкая и гранулярная или шероховатая (на ней находятся рибосомы)	синтез и внутриклеточный транспорт белков (шероховатая); синтез и распад липидов и углеводов (гладкая)
Аппарат Гольджи (пластинчатый комплекс)	состоит из полостей, уложенных в стопку. На концах полостей могут образовываться пузырьки, отделяющиеся от них	сортировка и упаковка макромолекул, транспорт веществ, участие в образование лизосом
Лизосомы	это пузырьки диаметром 5 мкм, содержащие гидролитические ферменты	расщепление органических веществ, старых частей клетки, целых клеток и даже отдельных органов (хвост головастика)
Вакуоль	только у растений (до 90% объема клетки). Крупная полость в центре клетки, заполненная клеточным соком	резервуар воды и растворенных в ней веществ, окраска, внутреннее (тургорное) давление клетки
Митохондрии	палочковидные, нитевидные или шаровидные органеллы с двойной мембраной - наружной гладкой и внутренней с многочисленными выростами (кристами). Между мембранами находится пространство. На внутренней мембране находятся ферменты. Внутри находится вещество, называемое матриксом, содержащее ДНК, РНК и митохондриальные рибосомы	участвуют в энергетическом обмене клетки
Пластиды	только у растений. Лейкопласты (бесцветные) обычны в органах растений, скрытых от солнечного света. Хлоропласты (зеленые) имеют две мембраны, внутри - матрикс. Хорошо развита внутренняя мембрана, имеющая складки, между которыми находятся пузырьки - тилакоиды. Часть тилакоидов собрано наподобие стопки в группы, называемые гранами. Хромопласты (желто-оранжевые) встречаются в окрашенных органах - лепестках, плодах, корнеплодах и осенних листьях. Внутренняя мембрана обычно отсутствует	фотосинтез, окраска, запас веществ
немембранные
клеточный центр	есть у животных и низших растений; у высших растений отсутствует. Состоит из 2 центриолей и микротрубочек	организация цитоскелета клетки; участие в делении клетки (образует веретено деления)
рибосомы и полисомы	это сферические структуры. Состоят из 2 субъединиц - большой и малой. Содержат р-РНК. Находятся на ЭПС или свободно в цитоплазме. Полисома - это структура, состоящая из одной и-РНК и нескольких рибосом, расположенных на ней.	синтез белка
опорно-двигательная система	образует цитоскелет клетки. В него входят микротельца, микротрубочки, микрофиламенты. Микрофиламенты состоят из глобулярных молекул белка актина. Микротрубочки - полые белковые цилиндры, находящиеся в ресничке или жгутике.	определяют форму клеток, участвуют в движении клетки, опорная функция

Клеточные включения - это непостоянные образования, то возникающие, то исчезающие в процессе жизнедеятельности клетки, т.е. это продукты клеточного метаболизма. Чаще всего находятся в цитоплазме, реже в органеллах или в ядре. Включения представлены главным образом гранулами (полисахариды: гликоген у животных, крахмал у растений; реже белки - в цитоплазме яйцеклеток), каплями (липиды) и кристаллами (оксалат кальция). К клеточным включениям относятся также некоторые пигменты - желтый и коричневый липофусцин (накапливается в процессе старения клеток), ретинин (входит в состав зрительного пигмента), гемоглобин, меланин и т.п.

Ядро. Основная функция ядра - хранение наследственной информации. Компонентами ядра являются ядерная оболочка, нуклеоплазма (ядерный сок), ядрышко (одно или два), глыбки хроматина (хромосомы). Ядерная оболочка эукариотической клетки обособляет наследственный материал (хромосомы) от цитоплаз­мы, в которой осуществляются многообразные метаболические реакции. Ядерная оболочка состоит из 2-х биологических мембран. Через определенные интервалы обе мембраны сливаются друг с другом, образуя поры - это отверстия в ядерной мембране. Через них происходит обмен веществ с цитоплазмой.

Основу нуклеоплазмы составляют белки, в том числе и фибриллярные. Она содержит ферменты, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот и рибосом. Также в ядерном соке содержится РНК.

Ядрышки - это место сборки рибосом, это непостоянные структуры ядра. Они исчезают в начале деления клетки и вновь появляются к его концу. В ядрышке различают аморфную часть и ядрышковую нить. Обе составляющие построены из филаментов и гранул, состоящие из белков и РНК.

Хромосомы. Хромосомы состоят из ДНК, которая окружена белками двух типов: гистоновыми (основными) и негистоновыми (кислыми). Хромосомы могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: спирализованном и деспирализованном . Частично или полностью деконденсированное (деспирализованное) состояние называется рабочим, т.к. в этом состоянии происходят процессы транскрипции и редупликации. Неактивное состояние - в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсации, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.

В интерфазе хромосомы представлены клубком тонких нитей, который различим только под электронном микроскопом. Во время деления хромосомы укорачиваются и утолщаются, они спирализованы и хорошо видны под микроскопом (лучше всего в стадии метафазы). В это время хромосомы состоят из двух хроматид, связанных первичной перетяжкой, которая делит каждую хроматиду на два участка - плеча.

По месту расположения первичной перетяжки выделяют несколько видов хромосом:

1. метацентрические или равноплечие (оба плеча хромосомы имеют одинаковую длину);
2. субметацентрические или неравноплечие (плечи хромосомы несколько отличаются по размеру);
3. акроцентрические (одно плечо очень короткое).

Метаболизм клетки.

Это одно из основных свойств живого. Метаболизм возможен благодаря тому, что живые организмы являются открытыми системами, т.е. между организмом и окружающей средой постоянно происходит обмен веществ и энергией. Метаболизм протекает во всех органах, тканях и клетках, обеспечивая самообновление морфологических структур и химического состава цитоплазмы.

Метаболизм складывается из двух процессов: ассимиляции (или пластиче­ского обмена) и диссимиляции (или энергетического обмена). Ассимиляция (пластический обмен) - совокупность всех процессов биосинтеза, проходящих в живых организмах. Диссимиляция (энергетический обмен) - совокупность всех процессов распада сложных веществ на простые с выделением энергии, проходящих в живых организмах.

По способу ассимиляции и в зависимости от вида используемой энергии и исходных веществ, организмы делятся на автотрофов (фотосинтетики и хемосинтетики) и гетеротрофов. Автотрофы - это организмы, самостоятельно синтезирующие органические вещества, используя для этого энергию Солнца (фотоавтотрофы ) или энергию окисления неорганических веществ (хемоавтотрофы ). К автотрофам относят растения, бактерии, сине-зеленые. Гетеротрофы - это организмы, получающие готовые органические вещества вместе с пищей. К ним относятся животные, грибы, бактерии.

Роль автотрофов в круговороте веществ огромна: 1) они трансформируют энергию Солнца в энергию химических связей органических веществ, которая используется всеми остальными живыми существами нашей планеты; 2) насыщают атмосферу кислородом (фотоавтотрофы), который необходим большинству гетеротрофов для получения энергии путем окисления органических веществ. Гетеротрофы также играют важную роль в круговороте веществ: они выделяют неорганические вещества (углекислый газ и вода), используемые автотрофами.

Диссимиляция. Все гетеротрофные организмы получают энергию в результате окислительно-восстановительных реакций, т.е. таких, в которых электроны переносятся от доноров электронов-восстановителей к акцепторам электронов - окислителям.

Энергетический обмен у аэробных организмов складывается из трех этапов:

1. подготовительного , который проходит в желудочно-кишечном тракте или в клетке под действием ферментов лизосом. Во время этого этапа происходит распад всех биополимеров до мономеров: белки распадаются сначала до пептидов, затем - до аминокислот; жиры - до глицерина и жирных кислот; углеводы - до моносахаридов (до глюкозы и ее изомеров).
2. бескислородного (или анаэробного), который проходит в матриксе цитоплазмы. Этот этап называют гликолизом . Под действием ферментов глюкоза расщепляется до двух молекул ПВК. При этом выделяется 4 атома Н, которые акцептируются веществом под названием НАД + (никотинамидадениндинуклеотид). При этом НАД + восстанавливается в НАД*Н (эта запасенная энергия в дальнейшем будет использоваться для синтеза АТФ). Также за счет распада глюкозы образуется 4 молекулы АТФ из АДФ. При этом 2 молекулы АТФ расходуется во время химических реакций гликолиза, поэтому суммарный выход АТФ после гликолиза составляет 2 молекулы АТФ.
3. кислородного , который проходит в митохондриях. Две молекулы ПВК поступают на ферментативный кольцевой «конвейер», который называют циклом Кребса или циклом трикарбоновых кислот. Все ферменты этого цикла находятся в митохондриях.

Попадая в митохондрии, ПВК окисляется и превращается в богатое энергией вещество - ацетил коэнзим А (это производное уксусной кислоты). Далее это вещество реагирует с ЩУК, образуя лимонную кислоту (цитрат), коэнзим А, протоны (акцептируются НАД + , который превращается в НАД*Н) и углекислый газ. В дальнейшем лимонная кислота окисляется и вновь превращается в ЩУК, которая реагирует с новой молекулой ацетил коэнзима А, и весь цикл повторяется заново. Во время этого процесса накапливается энергия в виде АТФ и НАД*Н.

Следующая стадия - превращение энергии, запасенной в НАД*Н, в энергию связей АТФ. В ходе этого процесса электроны от НАД*Н перемещаются по многоступенчатой цепи переноса электронов к конечному акцептору - молекулярному кислороду. При переходе электронов со ступени на ступень выделяется энергии, которая используется для превращения АДФ в АТФ. Поскольку в этом процессе окисление сопряжено с фосфорилированием, то весь процесс называют окислительным фосфорилированием (этот процесс был открыт русским ученым В.А. Энгельгардтом; он происходит на внутренней мембране митохондрий). В конце этого процесса образуется вода. Во время кислородного этапа образуется 36 молекул АТФ.

Таким образом, конечными продуктами распада глюкозы являются углекислый газ и вода. При полном распаде одной молекулы глюкозы выделяется 38 молекул АТФ. При нехватке кислорода в клетке происходит окисление глюкозы с образованием молочной кислоты (например, при интенсивной работе мышц - бег и т.п.). В результате этого образуется только две молекулы АТФ.

Необходимо отметить, что источником энергии могут служить не только молекулы глюкозы. Жирные кислоты также окисляются в клетке до ацетил коэнзима А, поступающий в цикл Кребса; при этом также происходит восстановление НАД + в НАД*Н, который участвует в окислительном фосфорилировании. При острой нехватке в клетке глюкозы и жирных кислот окислению подвергаются многие аминокислоты. Их них также образуется ацетил коэнзим А или органические кислоты, участвующие в цикле Кребса.

При анаэробном способе диссимиляции отсутствует кислородный этап, и энергетический обмен у анаэробов получил название «брожение». Конечные продукты диссимиляции при брожении - молочная кислота (молочно-кислые бактерии) или этиловый спирт (дрожжи). При таком типе обмена из одной молекулы глюкозы выделяется 2 молекулы АТФ.

Т.о., аэробное дыхание почти в 20 раз энергетически более выгодно, чем анаэробное.

Фотосинтез. Жизнь на Земле полностью зависит от фотосинтеза растений, поставляющих органическое вещество и О 2 всем организмам. При фотосинтезе происходит преобразование световой энергия в энергию химических связей.

Фотосинтез - это образование органических веществ из неорганических при участии солнечной энергии. Этот процесс был открыт К.А. Тимирязевым в 19-ом веке. Суммарное уравнение фотосинтеза: 6СО 2 + 6Н 2 О = С 6 Н 12 О 6 + 6О 2 .

Фотосинтез осуществляется в растениях, имеющих пластиды - хлоропласты . Хлоропласты имеют две мембраны, внутри - матрикс. У них хорошо развита внутренняя мембрана, имеющая складки, между которыми находятся пузырьки - тилакоиды . Часть тилакоидов собрано наподобие стопки в группы, называемые гранами . В гранах находятся все фотосинтетические структуры; в строме, окружающей тилакоиды, находятся ферменты, восстанавливающие углекислый газ до глюкозы. Основной пигмент хлоропластов - хлорофилл , по строению напоминающий гем человека. В состав хлорофилла входит атом магния. Хлорофилл поглощает синие и красные лучи спектра и отражает зеленые. Также могут присутствовать другие пигменты: желтые каротиноиды и красные или синие фикобилины. Каротиноиды маскируются хлорофиллом; они поглощают свет, не доступный для других пигментов и передают его хлорофиллу.

В составе хлоропластов есть две фотосистемы разного строения и состава: фотосистема I и II. Фотосистема I имеет реакционный центр, представляющий собой молекулы хлорофилла в комплексе с особым белком. Этот комплекс поглощает свет с длиной волны 700 нм (поэтому его называют фотохимическим центром Р700). В фотосистеме II также имеется реакционный центр - фотохимический центр Р680.

Фотосинтез имеет две стадии: световую и темновую.

Световая стадия. Энергия света поглощается хлорофиллом и переводит его в возбужденное состояние. Электрон в составе фотохимического центра Р700 поглощает свет, перемещается на более высокий энергетический уровень и переносится на НАДФ + (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), восстанавливая его в НАДФ*Н. В молекуле хлорофилла фотосистемы I остаются «дыры» - незаполненные места для электронов. Эти «дыры» заполняются электронами, пришедшими из фотосистемы II. Под действием света электрон хлорофилла в фотохимическом центре Р680 также приходит в возбужденное состояние и начинает перемещаться по цепи переносчиков электронов. В конечном итоге этот электрон приходит в фотосистему I, заполняя в ней свободные места. При этом электрон теряет часть энергии, которая расходуется на образование АТФ из АДФ.

Также в хлоропластах под действием солнечного света происходит расщепление воды - фотолиз , при котором образуются электроны (поступают в фотосистему II и занимают место электронов, ушедших в цепь переносчиков), протоны (акцептируются НАДФ +) и кислород (как побочный продукт):

2Н 2 О = 4Н + + 4е – + О 2

Таким образом, в результате световой стадии происходит накопление энергии в виде АТФ и НАДФ*Н, а также образование кислорода.

Темновая стадия. Не требует наличия света. Молекула углекислого газа при помощи ферментов реагирует с 1,5 рибулезодифосфатом (это производное рибозы). Образуется промежуточное соединение С 6 , которое разлагается водой на две молекулы фосфоглицериновой кислоты (С 3). Из этих веществ путем сложных реакций синтезируется фруктоза, которая далее превращается в глюкозу. Для этих реакций требуется 18 молекул АТФ и 12 молекул НАДФ*Н. Из глюкозы в растениях образуется крахмал и целлюлоза. Фиксация СО 2 и превращение его в углеводы носит циклический характер и называется циклом Кальвина .

Значение фотосинтеза для сельского хозяйства велико - именно от него зависит урожай сельскохозяйственных культур. При фотосинтезе растение использует лишь 1-2% солнечной энергии, поэтому имеется огромная перспектива повышения урожайности благодаря селекции сортов с более высокой эффективностью фотосинтеза. Для повышения эффективности фотосинтеза применяют: искусственное освещение (дополнительная подсветка лампами дневного света в пасмурные дни или весной и осенью) в теплицах; отсутствие затенения культурных растений, соблюдение необходимых расстояний между растениями и т.п.

Хемосинтез . Это процесс образования органических веществ из неорганических при использовании энергии, полученной при окислении неорганических веществ. Эта энергия запасается в виде АТФ. Хемосинтез открыт русским микробиологом С.Н. Виноградским в 19-ом веке (1889-1890 гг.). Этот процесс возможен у бактерий: серобактерии (окисляют сероводород до серы и даже до серной кислоты); нитрифицирующие бактерии (окисляют аммиак до азотной кислоты).

Репликация ДНК (удвоение ДНК). В результате этого процесса образуется две двойные спирали ДНК, которые ничем не отличаются от исходной (материнской). Сначала с помощью особого фермента (геликаза) двойная спираль ДНК расплетается в точках начала репликации. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы происходит синтез дочерних цепей ДНК. На одной из цепей процесс идет непрерывно - эта цепь называется лидирующей. Вторая цепь ДНК синтезируется короткими фрагментами (фрагментами Оказаки ), которые «сшиваются» вместе с помощью специальных ферментов. Эта цепь называется отстающей или запаздывающей.

Участок между двумя точками, в которых начинается синтез дочерних цепей, называется репликоном . У эукариот в ДНК имеется много репликонов, у прокариот только один репликон. В каждом репликоне можно видеть репликативную вилку - ту часть молекулы ДНК, которая уже расплелась.

Репликация основана на ряде принципов:

1. комплементарности (А-Т, Ц-Г) антипараллельности. Каждая цепь ДНК имеет определенную ориентацию: один конец несет ОН-группу, присоединенную к 3"-углероду в сахаре дезоксирибозе, на другом конце цепи находится остаток фосфорной кислоты в 5"-положении сахара. Две цепи ДНК ориентированы в противоположных направлениях, т.е. антипараллельно. Фермент ДНК-полимераза может передвигаться вдоль матричных цепей лишь в одном направлении: от их 3"-концов к 5"-концам. Поэтому в процессе репликации одновременный синтез новых цепей идет антипараллельно.
2. полуконсервативности. Образуются две дочерние спирали, каждая из которых сохраняет (консервирует) в неизменном виде одну из половин материнской ДНК
3. прерывистости. Чтобы новые нити ДНК могли образоваться, материнские цепи должны быть полностью раскручены и вытянуты, что невозможно; поэтому репликация начинается одновременно в нескольких местах.

Биосинтез белка. Примером пластического обмена у гетеротрофных организмов является биосинтез белка. Все основные процессы в организме связаны с белками, причем в каждой клетке постоянно происходит синтез белков, свойственных данной клетке и необходимых в данный период жизни клетки. Информация о молекуле белка зашифрована в молекуле ДНК с помощью триплетов или кодонов.

Генетический код - это система записи информации о последовательности расположения аминокислот в белках с помощью последовательности расположения нуклеотидов в и-РНК.

Свойства кода:

1. Триплетность - каждая аминокислота зашифрована последовательностью из трех нуклеотидов. Эта последовательность называется триплетом или кодоном.
2. Вырожденность или избыточность - каждая аминокислота шифруется более чем одним кодоном (от 2 до 6). Исключение составляют метионин и триптофан - каждая из них кодируются одним триплетом.
3. Однозначность - каждый кодон шифрует только одну аминокислоту.
4. Между генами имеются «знаки препинания» - это три специальных триплета (УАА, УАГ, УГА), каждый из которых не кодирует аминокислоты. Эти триплеты находятся в конце каждого гена. Внутри гена «знаков препинания» нет.
5. Универсальность - гентический код един для всех живых существ планеты Земля.

В биосинтезе белка различают три этапа - транскрипцию, посттранскрипционные процессы и трансляцию.

Транскрипция - это процесс синтеза и-РНК, осуществляемый ферментом РНК-полимера-зой. Происходит в ядре. Транскрипция осуществляется по правилу комплементарности. По длине и-РНК соответствует одному или нескольким генам. В процессе транскрипции можно выделить 4 стадии:

1. связывание РНК-полимеразы с промотором (это участок для прикрепления фермента).
2. инициация - начало синтеза.
3. элонгация - рост цепи РНК; последовательное присоединение нуклеотидов друг к другу в том порядке, в котором стоят комплементарные нуклеотиды нити ДНК. Ее скорость - до 50 нуклеотидов в секунду.
4. терминация - завершение синтеза пре-и-РНК.

Посттранскрипционные процессы. После образования пре-и-РНК начинается созревание или процессинг и-РНК. При этом из молекулы РНК удаляются интронные участки с последующим соединением экзонных участков (этот процесс называют сплайсингом ). После этого зрелая и-РНК выходит из ядра и направляется к месту синтеза белка (к рибосомам).

Трансляция - это синтез полипептидных цепей белков, выполняемый по матрице и-РНК в рибосомах.

Аминокислоты, необходимые для синтеза белка, доставляются в рибосомы с помощью т-РНК. Молекула транспортной РНК имеет форму листа клевера, на вершине которого имеется последовательность из трех нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам кодона в и-РНК. Эта последовательность называется антикодоном . Фермент (кодаза) опознает т-РНК и присоединяет к ней соответствующую аминокислоту (тратится энергия одной молекулы АТФ).

Биосинтез белка начинается с того (у бактерий), что кодон АУГ, расположенный на первом месте в копии с каждого гена, занимает место на рибосоме в донорном участке и к нему присоединяется т-РНК, несущая формилметионин (это измененная форма аминокислоты метионина). После завершения синтеза белка формилметионин отщепляется от полипептидной цепочки.

На рибосоме имеются два участка для связывания двух молекул т-РНК: донорный и акцепторный . В акцепторный участок поступает т-РНК с аминокислотой и присоединяется к своему кодону и-РНК. Аминокислота этой т-РНК присоединяет к себе растущую цепь белка, между ними возникает пептидная связь. т-РНК, к которой присоединен растущий белок, перемещается вместе с кодоном и-РНК в донорный участок рибосомы. В освободившийся акцепторный участок приходит новая т-РНК с аминокислотой, и все повторяется заново. Когда на рибосоме оказывается один из знаков препинания, ни одна из т-РНК с аминокислотой не может занять акцепторный участок. Полипептидная цепь отрывается и покидает рибосому.

Клетки разных тканей организма продуцируют разные белки (амилаза - клетки слюнных желез; инсулин - клетки поджелудочной железы и т.п.). При этом все клетки организма образовались из одной оплодотворенной яйцеклетки путем многократного деления с помощью митоза, т.е. имеют одинаковый генетический набор. Эти отличия связаны с тем, что в разных клетках транскрибируются разные участки ДНК, т.е. образуются разные и-РНК, по которым и синтезируются белки. Специализация клетки определяется не всеми генами, а только теми, с которых информация была прочтена и реализована в белки. Т.о., в каждой клетке реализуется только часть наследственной информации, а не вся информация целиком.

Регуляции генной активности при синтезе отдельных белков на примере бактерий (схема Ф.Жакоба и Ж Моно).

Известно, что пока в питательной среде, где обитают бактерии, не добавят сахар, в клетке бактерий нет ферментов, необходимых для его расщепления. Но через несколько секунд после добавления сахара в клетке синтезируются все необходимые ферменты.

Ферменты, участвующие в одной цепи превращения субстрата в конечный продукт, закодированы в расположенных друг за другом структурных генах одного оперона. Оперон - это группа генов, несущих информацию о структуре белков, необходимых для выполнения одной функции. Между структурными генами и промотором (место посадки РНК-полимеразы) есть участок, называемый оператором . Он так называется, потому что именно с него начинается синтез и-РНК. С оператором взаимодействует специальный белок - репрессор (подавитель) . Пока репрессор находится на операторе, синтез и-РНК не может начаться.

Когда в клетку попадает субстрат, для расщепления которого нужны белки, закодированные в структурных генах данного оперона, одна из молекул субстрата взаимодействует с репрессором. Репрессор теряет способность взаимодействовать с оператором и отходит от него; начинается синтез и-РНК и образование соответствующих белков на рибосоме. Как только последняя молекула субстрата будет преобразована в конечное вещество, освобожденный репрессор возвратится на оператор и заблокирует синтез и-РНК.

Использованная литература:

1. Ю. Ченцов «Введение в клеточную биологию» (2006)
2. В.Н. Ярыгин (редактор) «Биология» (в двух томах, 2006)
3. О.В. Александровская и др. «Цитология, гистология и эмбриология» (1987)
4. А.О. Рувимский (редактор) «Общая биология» (учебник для 10-11 классов с углубленным изучением биологии) - на мой взгляд, это один из лучших учебников по общей биологии для абитуриентов, хотя и не без недостатков.

Галилео-Галилей (1564 -1642) (итальянский философ, математик, физик и астроном, оказавший значительное влияние на науку своего времени; изобретатель микроскопа) Один из первых микроскопов (1876)

Световая микроскопия Роберт Гук (1635 -1703)1665 г – монография «Микрография» , где описаны его микроскопические и телескопические наблюдения

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ МИКРОСКОПА Современный световой микроскоп 1. Механическая часть 1. 1. Корпус 1. 2. Механический (предметный) столик 1. 3. Бинокулярная насадка 1. 4. Фокусировочный механизм 2. Осветительная система 2. 1. Источник света 2. 2. Коллектор 2. 3. Конденсор 3. Оптическая часть 3. 1. Объективы 3. 2. Окуляры

Ход лучей в стандартном микроскопе источник света конденсор образец объектив окуляр глаз Ход лучей в современном микроскопе источник света образецколлектор конденсор объектив окуля р изображение образца. УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ МИКРОСКОПА

Угол раскрытия объектива: РАЗРЕШЕНИЕ МИКРОСКОПА Формула Рэлея: Разрешение микроскопа по полю – минимальное расстояние между двумя точками формируемого им изображения, пока они еще видны раздельно. где – длина волны используемого света, n – показатель преломления среды, – угол раскрытия объектива. источник света образецколлектор конденсор объектив окуля р изображение образца Формула Аббе: где NA – численная апертура объектива, равная n sin (/2). NAd 61, 0 2/sin 2 n d

2 114 n. NA ndz Разрешение микроскопа по глубине – глубина фокуса. Формула Янга:

Дифракция лазерного луча с длиной волны 650 нм, прошедшего через отверстие диаметром 0, 2 мм МИКРОСКОП КАК ДИФРАКЦИОННЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ dxxuixuxfu. F)]2 sin()2)2 sin()2)}